上海惠诚生物提供DC细胞培养方案

【背景知识】

DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能zui强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是wei一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。

CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。

DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指与DC细胞共培养的CIK细胞，也可以说，终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。

CIK细胞和DC细胞是细胞*的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。

【培养原理】

1．DC培养用细胞因子：

1.1 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)

GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。

GM-CSF是早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。

1.2 IL-4 (白细胞介素-4)

IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表达CD14。

1.3 TNF-α (肿瘤坏死因子-α)

TNF-α可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可*的激活T细胞。

【细胞制备】

1．外周血单个核细胞的采集

1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100mL；

1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；

1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的 PBMC，细胞数量需达到1-3x10⁸。 

2. DC 细胞的培养及鉴定

2.1 步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 10^6/ml，置于培养瓶内；

2.2 37℃，5%CO2 培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；

2.3 吸去悬浮的细胞，剩下的贴壁细胞(主要是 CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；

3.2 每3d半量换液一次，并补足细胞因子；

3.3在培养的第6d，加入重组人TNF-a(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；

3.4在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×10^6个以上；

3.5 DC的质检：

3.5.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；

3.5.2 流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC 是否成熟。

4.收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。

【*试剂】

【其它相关试剂】